Relación entre los niveles plasmáticos de anandamida en plasma

Relación entre los niveles plasmáticos seminales de congéneres de anandamida palmitoiletanolamida y oleoiletanolamida y la calidad del semen

Akwasi Atakora Amoako, B.Sc., MB, Ch.B., MRCOG, Ph.D., Timothy Hywel Marczylo, Ph.D., b Janine Elson, MD, FRCOG, c Anthony Henry Taylor, Ph.D. , Jonathon M. Willets, Ph.D., a y Justin Chi Konje, MD, FRCOG a

un Grupo de Investigación de Endocannabinoides, Sección de Ciencia Reproductiva, Departamento de Estudios del Cáncer y Medicina Molecular, Universidad de Leicester, Leicester; b Centro de Radiación, Peligros Químicos y Ambientales, Agencia de Protección de la Salud, Didcot, Oxfordshire; y c London Women's Clinic, Londres, Reino Unido

Objetivo: determinar si los cambios en las concentraciones plasmáticas seminales de las moléculas de señalización de lípidos endógenos palmitoyle-thanolamide (PEA) y oleoylethanolamide (OEA) tienen efectos significativos sobre la calidad del esperma.

Diseño: estudios bioquímicos y fisiológicos de plasma seminal humano y espermatozoides.

Entorno: centro médico de atención terciaria.

Paciente (s): Noventa hombres que asisten a una clínica de infertilidad para el análisis del semen.

Intervención (es): La Palmitoiletanolamida y la OEA extraída del plasma seminal se cuantificaron mediante cromatografía líquida de ultra alta eficacia (HPLC), espectrometría de masas de sedán. Los espermatozoides del paciente de semen con parámetros normales se expusieron in vitro a PEA u OEA para determinar los efectos sobre la motilidad, la viabilidad y la actividad mitocondrial de los espermatozoides.

Principales medidas de resultado: la relación entre las concentraciones plasmáticas seminales de PEA y OEA y la calidad de los espermatozoides y el efecto de estos compuestos sobre la motilidad, la viabilidad y la actividad mitocondrial de los espermatozoides in vitro.

Resultado (s): Las concentraciones de palmitoiletanolamida y OEA en plasma seminal fueron menores en los hombres con astenozoospermia y oligoas-thenoteratozospermia en comparación con los hombres con parámetros de semen normales. Palmitoiletanolamida y OEA mejoraron de manera rápida y significativa la motilidad de los espermatozoides y mantuvieron la viabilidad sin afectar la actividad de las mitocondrias in vitro.

Conclusión (es): El mantenimiento del tono normal de PEA y OEA en plasma seminal humano puede ser necesario para la preservación de la función espermática normal y la fertilidad masculina. Exocannabinoides encontrados en Cannabis, como delta-9-tetrahidrocannabinol y

cannabidiol, podría competir con estos endocannabinoides alterando su funcionamiento equilibrado y normal y dando como resultado la falla reproductiva masculina. (Fertil Steril 2014; 102: 1260-7. 2014 por la Sociedad Americana de

Medicina reproductiva)

Palabras clave: palmitoiletanolamida, oleoiletanolamida, anandamida, sistema endocannabinoide, plasma seminal

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Recibido el 20 de enero de 2014; revisado y aceptado el 9 de julio de 2014; publicado en línea el 8 de septiembre de 2014.

AAA no tiene nada que revelar. THM no tiene nada que revelar. JE no tiene nada que revelar. AHT no tiene nada que revelar. JMW no tiene nada que revelar. JCK no tiene nada que revelar.

Dirección actual de AAA: Leeds Center for Reproductive Medicine, Leeds Teaching Hospitals NHS Trust, Seacroft Hospital, Leeds LS14 6UH, Reino Unido.

Apoyado en parte por fondos educativos misceláneos del Fideicomiso de Servicios Nacionales de Salud de los Hospitales Universitarios de Leicester para apoyar el Laboratorio de Investigación de Endocannabinoides de la Universidad de Leicester.

Solicitudes de reimpresión: Akwasi Atakora Amoako, B.Sc., MB, Ch.B., MRCOG, Ph.D., y Justin Chi Konje, MD, FRCOG, Grupo de Investigación de Endocannabinoides, Sección de Ciencias Reproductivas, Departamento de Estudios del Cáncer y Medicina Molecular , Universidad de Leicester, Leicester, Reino Unido (E-mail: akwasi.amoako@leedsth.nhs.uk).

Fertility and Sterility® Vol. 102, No. 5, noviembre de 2014 0015-0282 / $ 36.00

Copyright © 2014 Sociedad Americana de Medicina Reproductiva, Publicado por Elsevier Inc. http://dx.doi.org/10.1016/j.fertnstert.2014.07.767

La infertilidad afecta a una de cada seis parejas (15% -20%) que intentan lograr el embarazo (1-4). Los factores femeninos son responsables de la mitad de los casos de infertilidad, mientras que los factores masculinos puros o en asociación con factores femeninos representan el 50% restante (3, 5). La infertilidad por factor masculino es un problema complejo y creciente (6) con causas multifactoriales y generalmente presente como cualitativo o cuantitativo

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defectos de esperma en forma de deficiencia de producción de esperma, transporte y / o morfología (7). El análisis de semen sigue siendo el método estándar de evaluación de la infertilidad del factor masculino, pero no logra dilucidar las causas de la disfunción del esperma. Estudios recientes se han centrado en varias moléculas con significado predictivo del potencial reproductivo masculino. Entre estos se encuentra un grupo de mediadores lipídicos, los endocannabinoides que están emergiendo como biomarcadores potenciales de la salud reproductiva masculina (8).

Endocannabinoide son medios lipídicos bioactivos endógenos-

que se unen a los receptores cannabinoides e imitan los efectos reproductivos adversos del Cannabis. Los endocannabinoides, su

objetivos moleculares, enzimas sintéticas y de degradación, y transportadores de proteínas constituyen el sistema endocannabinoide. Los receptores de cannabinoides se identificaron primero como dianas moleculares para el D9-tetrahidrocannabinol, el principio activo de la marihuana y luego se demostró que son dos receptores cannabinoides acoplados a proteína G bien caracterizados, CB1 y CB2 (9, 10), que también se unen a endocannabinoides. .

La N-araquidonoiletanolamida (Anandamida, AEA) es el miembro más extensamente estudiado de este grupo de ligandos y se distribuye ampliamente en la mayoría de los tejidos centrales y periféricos, incluido el sistema reproductivo (11-13). La AEA y sus congéneres oleoiletanolamida (OEA) y palmitoiletanolamida (PEA), comúnmente denominadas N-aciletanolamidas, son moléculas hidrófobas presentes en el bajo rango nanomolar en muchos tejidos y células de mamíferos y producidas a partir de precursores de fosfolípidos de la membrana celular en respuesta a agentes despolarizantes , neurotransmisores y hormonas (14, 15). Parecen ocurrir siempre juntos en tejidos y biofluidos, lo que sugiere una vía de producción común.

La oleoiletanolamida y la PEA no activan los receptores cannabinoides clásicos CB1 y CB2 y sus funciones biológicas exactas siguen siendo difíciles de alcanzar. Se pretende que actúen como "compuestos de acompañantes", por lo que mejoran la actividad biológica de la AEA al inhibir su degradación por la enzima ácido graso amida hidrolasa, actuando como sustratos alternativos. Las concentraciones de AEA, PEA y OEA se han detectado a niveles nanomolares en fluidos y tejidos reproductivos humanos, como el fluido oviductal de mitad de ciclo, el líquido folicular (FF) y el plasma seminal (16-18), y se ha demostrado que los espermatozoides son secuencialmente expuestos a niveles decrecientes de AEA mientras nadan desde el eyaculado depositado en la vagina hasta el sitio de fertilización en la ampolla oviductal (18).

Varios estudios in vitro han demostrado una inhibición dependiente de la dosis de las funciones espermáticas de los mamíferos mediante AEA mediada por la activación del receptor CB1 (19-21). En los espermatozoides humanos maduros, la AEA reduce la motilidad, la capacitación y la exocitosis de los espermatozoides (21). Del mismo modo AEA ejerce un papel inhibidor en las funciones espermáticas en varias especies (18, 19, 21, 22) mediante la inhibición de la actividad mitocondrial que conserva la energía y garantiza la adquisición gradual de la capacidad de fertilización espermática durante el ascenso a través del aparato reproductor femenino (23). De manera similar, el D9-tetrahidrocannabinol interfiere con las vías de señalización endógena corriente abajo, la modulación de las funciones espermáticas y la reproducción masculina en invertebrados y mamíferos (18, 19, 21, 24).

Fertilidad y esterilidad®

Se cree que se requiere un "tono endocannabinoide" crítico para el mantenimiento de los espermatozoides de mamíferos en el estado normal y la pérdida de estas funciones de protección endocannabinoide resulta en la disfunción de los espermatozoides y la pérdida del potencial de fertilización. El apoyo para esto proviene de las observaciones de que la regulación negativa del tono de AEA y la expresión de CB1 en plasma seminal y espermatozoides, respectivamente, ocurre en hombres con parámetros de semen anormales, lo que indica que la señalización endocannabinoide aberrante en esperma-tozoa humana juega un papel relevante en la etiopatogenia de la disfunción espermática humana (25, 26).

Las concentraciones de palmitoiletanolamida y OEA en la mayoría de los tractos y fluidos reproductivos humanos son más altas que las de AEA, y las nuevas evidencias sugieren que PEA y OEA poseen actividades antioxidantes, antiinflamatorias y antimicrobianas que podrían proteger a las células espermáticas del daño oxidativo, la inflamación y la actividad microbiana. Por ejemplo, la suplementación de PEA y OEA mejora la actividad antioxidante de los espermatozoides, mejora los parámetros cinemáticos de los espermatozoides y la hiperactivación, y protege las células del daño oxidativo en algunos casos de infertilidad idiopática (27-29).

Propusimos que los niveles plasmáticos seminales de PEA y OEA pueden reflejar la calidad del esperma. Por lo tanto, los objetivos de este estudio fueron explorar las posibles relaciones entre las concentraciones plasmáticas seminales de PEA y OEA y la calidad del semen, y determinar los efectos de estos compuestos en los espermatozoides humanos in vitro.

MATERIALES Y MÉTODOS

Productos químicos

El dimetilsulfóxido (DMSO) y el ácido fórmico eran de Sigma Aldrich. Palmitoiletanolamida, OEA, y sus equivalentes deuterados (PEA-d4 y OEA-d2), cada uno de> 98% de pureza (y> 99% de contenido deuterado), y 5,5 0 , 6,6 0 -tetracloro-1,1 0 , Se adquirió yoduro de 3,3 - tetra - etilbencimidazolil carbocianina (JC - 1) de Cayman Chemicals. El grado de cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) de acetonitrilo, cloroformo, metanol y acetato de amonio se adquirió de Fisher Scientific y se obtuvo agua de grado HPLC usando un sistema de purificación de agua (Maxima ELGA, ELGA). Las fases móviles se filtraron a través de filtros de politetrafluoroetileno de 0,2 mm de diámetro y 47 mm de diámetro (Waters UK Ltd.) antes de su uso. Se compraron cartuchos de extracción en fase sólida Oasis hidrofílico-lipófilo (HLB) (1 ml, 30 mg) de Waters. El kit de viabilidad de esperma vivo / muerto se obtuvo de Invitrogen.

Diseño del estudio

Este estudio prospectivo fue aprobado y conducido de acuerdo con las directrices del comité de ética de investigación local de Leicestershire y Rutland y todos los participantes firmaron el consentimiento informado para participar. El semen se obtuvo de hombres que asistieron a la Unidad de Andrología de la Royal Infirmary de Leicester, un hospital afiliado de la Facultad de Medicina de la Universidad de Leicester para el análisis de semen de rutina. Se recogió semen de 90 pacientes consecutivos mediante la masturbación en un recipiente de plástico estéril después de 2-5 días de abstinencia sexual. Las muestras se dejaron licuar a temperatura ambiente durante

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ARTÍCULO ORIGINAL: ANDROLOGÍA

1 hora. A partir de una alícuota del semen, los parámetros seminal estándar fueron examinados por un técnico de laboratorio capacitado con la debida consideración de la medida interna de control de calidad del departamento y de acuerdo con los criterios de la Organización Mundial de la Salud (30). Los valores normales de referencia de la Organización Mundial de la Salud fueron volumen de semen> 2 ml; concentración de espermatozoides> 20 10 6 / ml; número de espermatozoides por ejaculum de> 40 10 6 ; y motilidad espermática de R50% con progresión progresiva (grados a y b) o R25% con movilidad progresiva (grado a). Se excluyeron los pacientes con uso previo o actual de drogas recreativas, el uso actual de cualquier medicamento (excepto los medicamentos de venta libre), la presencia de cualquier enfermedad sistémica o un historial de vasectomía. Los 90 participantes se caracterizaron y se colocaron en uno de cinco grupos como normo-zoospermia (n = 45), asthenozoospermia (n = 11), oligoasthe-notaratozoospermia (n = 22), teratozoospermia (n = 8) o azoospermia (n ¼ 4).

Medición de PEA y OEA en plasma seminal humano

El semen fue transportado al laboratorio analítico sobre hielo y procesado dentro de las 2 horas de la producción. El fluido se transfirió a un vial de centelleo Kimble limpio de 7 ml (Kinesis) y se centrifugó a 1.200 g durante 30 minutos a 4ºC para separar el plasma seminal de los espermatozoides y otras células contaminantes. El sobrenadante se transfirió luego a un vial de centelleo Kimble limpio de 7 ml y la extracción de lípidos se realizó inmediatamente, como se describió previamente (31, 32). Para el análisis y la cuantificación de PEA y OEA en las muestras de 90 muestras de semen, se utilizó un método de espectrometría de masas por electronebulización en tándem Ultra HPLC previamente validado (31, 32).

Preparación de esperma para experimentos in vitro

Los experimentos in vitro se realizaron en medio modificado Biggers, Whitten Whittingham (BWW) (D-glucosa 5,6 mM, lactato sódico 44 mM, piruvato sódico 0,27 mM, NaCl 95 mM, KCl 4,6 mM, CaCl2 1,7 mM, KH2 PO 1,2 mM). 4 , 1,2 mM de MgSO 4 , 5 U / ml de penicilina, 5 mg / ml de estreptomicina, tamponado con 20 mM de N-2-hidroxietilpiperazina-N 0 -2-ácido etanosulfónico [HEPES], y suplementado con 0,3% de albúmina de suero bovino [BSA ], pH ajustado a 7.4). Para estos experimentos, solo se usaron muestras de semen donadas por voluntarios sanos con parámetros normales de la Organización Mundial de la Salud. Después de la licuación del semen durante aproximadamente 30 minutos, los espermatozoides móviles se seleccionaron mediante la técnica de inmersión directa en medio BWW. Brevemente, 1 ml de BWW tamponado con HEPES (20 mM) y pH ajustado a 7,4 se recubrió con 0.3 ml de la muestra licuada en un tubo de poliestireno Falcon de fondo redondo (Becton Dickinson) y se incubó durante 1 hora a 37ºC, 5%. CO 2 , y en un ángulo de 45. Después de la incubación, 700 ml se aspiraron cuidadosamente de la capa superior de cada tubo, conteniendo las células móviles, se combinaron en un tubo Falcon de poliestireno de 15 ml, se lavaron dos veces (700 g durante 7 minutos) y se resuspendieron en medio BWW (33). La concentración de espermatozoides se determinó utilizando una cámara de recuento Neubauer, de acuerdo con la Organización Mundial de la Salud.

métodos de fijación (30) y ajustado a 10 millones de células / ml con medio BWW. Las soluciones madre de PEA y OEA (1 mM en DMSO) almacenadas a 20ºC se diluyeron a la concentración requerida inmediatamente antes de cada experimento en 1 ml de medio de cultivo BWW, de modo que la concentración final de DMSO fue del 0,2% (vol / vol) , con el mismo volumen de DMSO en medio BWW utilizado en todos los experimentos de control (los experimentos preliminares mostraron que el 0,2% de DMSO no tuvo efectos significativos en la motilidad de los espermatozoides).

Efecto de PEA y OEA en la movilidad y viabilidad de los espermatozoides

Se tomaron alícuotas de esperma suspendido (10 ml) 15, 30, 45, 60 y 90 minutos después de la adición de PEA u OEA para examinar el efecto dependiente del tiempo de estos sobre la motilidad de los espermatozoides. Las curvas de dosis-respuesta se construyeron incubando alícuotas de la suspensión de esperma (10 10 6 / ml) sin (control) o con concentraciones crecientes de PEA u OEA (1 nM-10 mM) durante 30 minutos. La motilidad de los espermatozoides se evaluó colocando 10 ml de suspensión de esperma sobre un portaobjetos de vidrio plano recubierto con un cubreobjetos de 22 mm y 22 mm montado en un microscopio de contraste de fase con una etapa calentada para mantener la temperatura de deslizamiento a 37 ° C. Un total de 200 obtuvieron puntajes de diferentes campos y la proporción de espermatozoides móviles se expresó como un porcentaje del total de espermatozoides móviles. Cada muestra se analizó en triplicado y el valor promedio se tomó como el porcentaje de motilidad. Una cuarta muestra se analizó donde hubo> 10% de variación entre las tres muestras. Todos los análisis fueron realizados por el equipo de investigación bajo la supervisión de un técnico de laboratorio capacitado. El efecto de PEA u OEA sobre la viabilidad de los espermatozoides se evaluó después de 6 horas de incubación utilizando el LIVE / DEAD Sperm Viability Kit (Invitrogen), de acuerdo con las instrucciones del fabricante mediante SYBR-14 (verde) y PI (rojo) fluorescencia celular patrones de etiquetado a 400 aumentos en un Nikon Eclipse 300 mi-croscope. Un total de 200 células de ocho campos seleccionados al azar se examinaron para determinar la fluorescencia verde y roja y la viabilidad de los espermatozoides se expresó como un porcentaje de las células que inhiben la fluorescencia verde.

Evaluación por citometría de flujo del potencial de membrana mitocondrial

El colorante catiónico lipófilo JC-1 se utilizó para evaluar el estado mitocondrial mediante la caracterización del potencial de membrana mitocondrial (Djm) de los espermatozoides, como se describió previamente (26). Brevemente, se incubaron alícuotas de 1 ml de espermatozoides (5 10 6 / ml) con concentraciones crecientes de PEA u OEA (1 nM-1 mM) a 37 C bajo una atmósfera de CO 2 al 5% en aire durante 15 minutos, después de lo cual 0,15 Se añadió mmol / l de JC-1 y las células se incubaron adicionalmente durante 30 minutos. Los potenciales de membrana mitocondrial JC-1 verde (monomérico bajo) y naranja (multimérico alto) se controlaron mediante citometría de flujo usando un clasificador de células BD FACSAria II (BD Biosciences) equipado con un láser de argón de 488 nm como fuente de luz de excitación. . Se recolectó un total de 10,000 eventos cerrados por muestra a una velocidad de 500 eventos / s. Las actividades sin esperma fueron cerradas 1262 VOL. 102 NO. 5 / NOVIEMBRE 2014

Fertilidad y esterilidad®

TABLA 1

Características del semen y concentraciones medias de NAE en los grupos de estudio (expresadas como mediana e intervalo de confianza del 95%).

Variable

Volumen (mL)

Recuento de espermatozoides (310 6 / mL)

Motilidad (%)

Formas normales (%)

Normozoospermia (n = 45)

3.0

(2.9-3.9)

156

(129-187)

72 (67-73)

50

(44-51)

Asthenozoospermia (n ¼ 11)

2.0

(1.7-3.7)

80

(42-158)

32 (22-40)

24

(12-36)

Teratozoospermia (n = 8)

3.3

(2.2-4.7)

49

(32-82)

54 (31-69)

5

(2-16)

Oligoastrenoteratozoospermia (n = 22)

3.2

(1-5.9)

4

(3-10)

31 (22-40)

12

(8-18)

Azoospermia (n = 4)

3.8

(3.2-4.7)


N / A

N / A


N / A

Nota: NA ¼ no disponible; NAE ¼ N-aciletanolamida.

Amoako. Endocannabinoides en la reproducción masculina. Fertil Steril 2014.

fuera de las células de interés en función de la dispersión directa y la dispersión lateral de la población de espermatozoides registrada en el modo lineal. Las fluorescencias verde y naranja JC-1 se detectaron a 530 nm y 610 nm, respectivamente. Los datos de citometría de flujo se analizaron con el software BD FACSDiVa (BD Biosciences) en el modo logarítmico. La población de células teñidas de naranja se registró como el porcentaje de células con un alto potencial de membrana mitocondrial.

Análisis estadístico

El análisis estadístico se realizó con Graphpad (Instat versión 3, software Graphpad). La comparación estadística de las concentraciones de endocannabinoides en hombres con parámetros seminales normales y patológicos se logró utilizando un análisis de varianza de una vía Kruskal-Wallis (ANOVA) con la prueba post ad hoc de Dunn. Para los experimentos in vitro, las comparaciones entre las muestras tratadas y de control se lograron mediante el uso de ANOVA de una vía con la prueba posterior de Dunnett. En todos los casos, P <.05 se="" consideró="" estadísticamente="">

RESULTADOS

Relación entre niveles de plasma seminal de PEA y OEA y calidad de semen

Los criterios de la Organización Mundial de la Salud para la concentración, motilidad y morfología de los espermatozoides se utilizaron para agrupar a los 90 hombres en 5 grupos patológicos y normales: asthenozoospermia, oligoastenoteratozoospermia, teratozoospermia, azooespermia o normozoospermia. Los cinco grupos tenían una edad promedio similar y sus parámetros básicos de semen se muestran en la Tabla 1.

Las concentraciones plasmáticas seminales de PEA fueron significativamente menores en los hombres con asthenozoospermia (mediana, 6,23 nM, rango intercuartílico [IQR], 2,88-7,58; intervalo de confianza [IC] del 95%: 3,51-7,38) y oligoastenoteratozoospermia (mediana, 3,02 nM; IQR, 2.17-8.44; IC del 95% 3.29-7.25) en comparación con los controles normozoospérmicos (mediana, 11,94 nM; RIQ, 7,81-15,17; IC del 95%: 10,44 a 16,08). No se observó una diferencia significativa entre los hombres con teratozoospermia (mediana, 10,62 nM; IQR, 5,64-21,39; IC del 95%: 3,51-7,38) o

FIGURA 1

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Relación entre los niveles plasmáticos seminales de palmitoiletanolamida (PEA) y oleoiletanolamida (OEA) y la calidad del semen. Los niveles plasmáticos seminales de (A) PEA y (B) OEA se cuantificaron mediante cromatografía líquida ultraelevada-espectrometría de electrospray-ionización-masa en tándem en hombres con normozoospermia, astenozoospermia, teratozoospermia, azoospermia y oligoastenoteratozoospermia. Los datos se informan como mediana y rango intercuartílico y todas las muestras se procesaron como duplicados. La comparación entre los grupos se realizó utilizando el análisis de varianza de una vía de Kruskal-Wallis (ANOVA) seguido de la prueba posterior ad hoc de Dunn. * P, ** P, *** P representa los datos significativamente (P <.05, p=""><.01 y="" p=""><.001, respectivamente)="" y="" ns="" representa="" datos="" no="" significativamente="" menores="" que="" la=""> NOR ¼ normozoospermia (n = 45); AST ¼ asthenozoospermia (n = 11); TER = teratozoospermia (n = 8); AZO ¼ azoospermia (n = 4); OAT ¼ oligoastrenoteratozoospermia (n = 22).

Amoako. Endocannabinoides en la reproducción masculina. Fertil Steril 2014.

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azoospermia (mediana, 5,77 nM; IQR, 3,55 - 16,49; IC del 95%: -3,55 - 20,76) en comparación con los controles normozoospérmicos (Fig. 1A). Las concentraciones plasmáticas seminales de OEA fueron significativamente más bajas en los hombres con asthenozoospermia (mediana, 0,86 nM; IQR, 0,35-0,95; IC del 95%: 0,50-0,89), oligoastenoter-atozoospermia (mediana, 0,52 nM; IQR, 0,29-0,87; 95 % CI 0.47-0.74) y azoospermia (mediana, 0.29 nM; IQR, 0.24-

0.39; IC del 95%: 0,19 a 0,41) en comparación con los controles normozoospiritémicos (mediana, 1,52 nM; RIQ, 0,57-2,30; IC del 95%: 1,24-2,26), aunque no se observaron diferencias significativas con los hombres con teratozoospermia (mediana, 1,02 nM ; IQR, 0,46 - 1,74; IC del 95%: 0,06 - 2,93) (Fig. 1B).

Tiempo y efectos dependientes de la dosis de PEA y OEA en la motilidad de los espermatozoides

Después de 15-90 minutos de incubación, la PEA ejerció un aumento significativo (P <.001) dependiente="" del="" tiempo="" en="" la="" motilidad="" progresiva="" de="" los="" espermatozoides="" (77%,="" 81%,="" 81%,="" 80%="" y="" 80%="" a="" los="" 15,="" 30,="" 45="" ,="" 60,="" y="" 90="" minutos,="" respectivamente),="" mientras="" que="" los="" espermatozoides="" de="" control="" en="" los="" tiempos="" correspondientes="" mostraron="" una="" disminución="" significativa="" (70%,="" 70%,="" 69%,="" 69%="" y="" 67%)="" (fig.=""> Oleoylethanola-mide también indujo un aumento significativo (P <.001) dependiente="" del="" tiempo="" en="" la="" motilidad="" progresiva="" de="" los="" espermatozoides="" (74%,="" 77%,="" 79%,="" 79%="" y="" 76%,="" respectivamente)="" en="" comparación="" con="" los="" controles="" en="">

FIGURA 2

image022.jpg

tiempo correspondiente (69%, 69%, 69%, 67% y 67%) (Fig. 2B). Exponer los espermatozoides a dosis crecientes de PEA u OEA (10 nM-10 mM) durante 30 minutos produjo un aumento significativo dependiente de la dosis en el porcentaje de motilidad espermática progresiva para PEA y OEA (ANOVA de una vía, P> .05; n ¼ 6) (Fig. 2C y D).

Efecto de PEA y OEA sobre la viabilidad de los espermatozoides y la actividad de las mitocondrias

El tratamiento de los espermatozoides con dosis crecientes de PEA (10 nM-10 mM) durante 6 horas dio como resultado un importante mantenimiento dependiente de la dosis de la viabilidad de los espermatozoides en comparación con los espermatozoides control (P <.001, anova="" de="" una="" vía;="" n="6)" (fig.=""> El efecto de la OEA (10 nM-10 mM, 6 horas) sobre la viabilidad de los espermatozoides también reapareció en un mantenimiento dependiente de la dosis significativo de la viabilidad de los espermatozoides en comparación con el control del vehículo (p <0,001, anova="" de="" una="" vía;="" n="" ¼="" 6)="" (fig.=""> La incubación con una concentración de hasta 10 mM, PEA u OEA no indujo ningún cambio significativo en la actividad mitocondrial de los espermatozoides, medida por el potencial de membrana mitocondrial (Fig. 3C y D).

DISCUSIÓN

La infertilidad masculina es un problema global que está en aumento y aunque se desconoce la etiopatología precisa

Efecto de palmitoiletanolamida (PEA) y oleoiletanolamida (OEA) en la motilidad de los espermatozoides. Los espermatozoides humanos se incubaron en medio Biggers, Whitten Whittingham (BWW) a 37 C en una incubadora con CO 2 al 5% y se estimularon con (azul) o sin (rojo) (A) PEA o (B) OEA (1 mM) hasta 90 minutos. Se tomaron alícuotas de 10 ml a los 15, 30, 45, 60 y 90 minutos y se evaluó la movilidad de los espermatozoides mediante microscopía de contraste de fases. Los datos se expresan como media SEM (n = 4 experimentos separados). Las diferencias significativas se determinaron mediante el análisis de varianza de dos vías (ANOVA). La comparación por pares entre los controles tratados y los que coinciden con el tiempo se determinó mediante la prueba t de Student emparejada; * P <.05, **="" p=""><.01, ***="" p=""><> Los espermatozoides humanos se incubaron en medio BWW a 37ºC y se estimularon con o sin concentraciones crecientes de PEA (C) u OEA (D) durante hasta 30 minutos. Se tomaron alícuotas de 10 ml y se evaluó la motilidad de los espermatozoides mediante microscopía de contraste de fases y se expresó como un porcentaje de espermatozoides móviles. Las columnas son SEM medias de seis experimentos independientes realizados por duplicado. Las diferencias significativas se determinaron mediante ANOVA de una vía y la prueba post hoc de Dunnett; ** P <.01, ***="" p=""><.001 versus="">

Amoako. Endocannabinoides en la reproducción masculina. Fertil Steril 2014.

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FIGURA 3

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Efecto de palmitoiletanolamida (PEA) y oleoiletanolamida (OEA) sobre la viabilidad de los espermatozoides y la actividad mitocondrial. Los espermatozoides humanos se incubaron en medio Biggers, Whitten Whittingham (BWW) a 37ºC en una incubadora de CO2 al 5% y se estimularon con o sin concentraciones crecientes de (A) PEA o (B) OEA (10 nM-10 mM) hasta para 6 horas. La viabilidad de los espermatozoides se midió mediante el ensayo de viabilidad de los espermatozoides vivos / muertos y la microscopía de fluorescencia y se expresó como porcentaje de espermatozoides viables. Las columnas son SEM medias de seis experimentos independientes realizados por duplicado. Las diferencias significativas se determinaron mediante el análisis de varianza de una vía (ANOVA) y la prueba post hoc de Dunnett. ** P <.01, ***="" p=""><.001 versus="" 0="" nm="" pea="" u=""> Los espermatozoides humanos se incubaron en medio BWW a 37ºC en una incubadora de CO2 al 5% y se estimularon con o sin concentraciones crecientes de (C) PEA o (D) OEA (10 nM-1 mM) durante hasta 30 minutos. Se tiñeron alícuotas de la suspensión de esperma con colorante de fluorescencia JC-1 y se monitorizó la actividad de la mitocondria mediante citometría de flujo. Los gráficos indican el porcentaje de células espermáticas que muestran fluorescencia naranja, lo que indica una mayor actividad mitocondrial, en presencia de las dosis indicadas de PEA u OEA. Los datos se expresan como media SEM de cuatro experimentos separados, cada uno ejecutado en duplicados.

Amoako. Endocannabinoides en la reproducción masculina. Fertil Steril 2014.

en la mayoría de los casos, la función defectuosa de los espermatozoides del estrés oxidativo ha sido implicada (34). Esto es el resultado de un aumento en las especies de oxígeno reactivo (ROS) o una disminución en la capacidad antioxidante del cuerpo que da como resultado un daño peroxidativo a la membrana plasmática del espermatozoide. El ROS desempeña un papel significativo en los eventos de maduración espermática posyaculatoria, como la capacitación y la reacción acrosómica, pero puede causar daño irreversible a la membrana plasmática del espermatozoide a altas concentraciones. Esto puede ocasionar la pérdida de la motilidad de los espermatozoides y la fragmentación del ADN de los espermatozoides, causando disfunción de los espermatozoides y pérdida del potencial de fertilización. Por lo tanto, se sugirió que un equilibrio entre la generación de ROS y la capacidad antioxidante total juega un papel crítico en la fisiopatología del estado de la enfermedad (35). Varios agentes antioxidantes, enzimáticos (superóxido dismutasa, catalasa y glutatión peroxidasa) y no enzimáticos (p. Ej., A-tocoferol, b-caroteno, ascorbato, urato), se han utilizado como suplementos antioxidantes para proteger las células espermáticas (36). . Estos agentes están presentes en el plasma seminal, y su uso para mejorar los parámetros del semen sigue siendo controvertido. Aunque estudios anteriores no mostraron ninguna mejora en los parámetros del semen después de la administración de suplementos antioxidantes (37), estudios más recientes han mostrado evidencia de beneficio (38-40). La evidencia emergente sugiere que las N-aciletanolamidas, especialmente PEA y OEA, tienen propiedades antioxidantes, antimicrobianas y antiinflamatorias y pueden inhibir los radicales inducidos por la oxidación in vitro de los lípidos (41, 42). Estos compuestos han demostrado en estudios previos que inhiben la producción de óxido nítrico en los macrófagos (43) y protegen el corazón de rata aislado de la isquemia (44) por sus efectos antioxidantes. La presencia de concentraciones más altas de estos compuestos en el plasma seminal sugiere que pueden contribuir a la capacidad antioxidante de los fluidos reproductivos humanos, lo que podría explicar sus efectos beneficiosos sobre la capacitación, motilidad y viabilidad de los espermatozoides (27-29). La fuente de PEA y OEA en plasma seminal sigue siendo desconocida y no se ha explorado en este estudio. Sin embargo, los propios espermatozoides pueden ser la fuente, ya que poseen el aparato bioquímico para la síntesis y degradación de PEA y OEA (26). La contribución de epidydimis, próstata y vesículas seminales es posible. Además, los receptores cannabinoides y las enzimas sintéticas y de degradación de endocannabinoides se han localizado en

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ARTÍCULO ORIGINAL: ANDROLOGÍA

epitelio tubario de las trompas de Falopio, que indica la exposición de los espermatozoides a los endocannabinoides en el tracto genital femenino (45-48).

En el presente estudio, la relación entre las concentraciones plasmáticas seminales de PEA y OEA y las anormalidades y funciones de los espermatozoides humanos mostró diferencias notables en las concentraciones de OEA y PEA en hombres con diferentes subtipos de semen patológico, con niveles más bajos asociados con disminución del conteo espermático y motilidad espermática anormal . Esta observación indica que para mantener el conteo y la motilidad de espermatozoides normales, se requieren niveles más altos de PEA y OEA en el tracto genital masculino. Esto sugiere que la PEA y la OEA pueden desempeñar funciones fisiológicas importantes en el tracto genital masculino y, por lo tanto, la pérdida de "tono de PEA y / o OEA" en hombres con parámetros anormales del semen puede indicar una señalización endocannabinoide aberrante en los espermatozoides humanos. Esto puede ser relevante en la etiopatogenia de la disfunción espermática humana y la fertilidad masculina comprometida. Por lo tanto, la desregulación del sistema endocannabi-noide endógeno durante la diferenciación y / o maduración de los espermatozoides probablemente resulte en la producción de espermatozoides con morfología anormal y niveles más altos de fragmentación de ADN. Esta es una característica común asociada con los espermatozoides de los hombres con asthenozoospermia y oligoastrenoteratozo-espermia. Los efectos de PEA y OEA sobre la motilidad, la viabilidad y la actividad mitocondrial de los espermatozoides humanos se examinaron para comprender el papel potencial de estos compuestos en la función espermática humana. Tanto PEA como OEA aumentaron significativamente la motilidad de los espermatozoides de una manera dependiente del tiempo y de la concentración y mantuvieron significativamente la viabilidad de los espermatozoides in vitro durante un período de 6 horas de una manera dependiente de la concentración. El efecto rápido de PEA y OEA en la motilidad de los espermatozoides apoya la hipótesis de una acción protectora de PEA y OEA contra ROS, lo que podría explicar sus efectos beneficiosos sobre los espermatozoides ca pacitados in vitro (27-29). Palmitoylethanolamide y OEA se han demostrado a concentraciones fisiológicas, como se detectó en estos hombres, para aumentar los parámetros cinemáticos, como la velocidad curvilínea y la amplitud del desplazamiento lateral de la cabeza y la hiperactivación, en presencia y ausencia de estrés oxidativo (27-29). La exposición in vitro de espermatozoides humanos a PEA y OEA confiere cierta protección contra el daño oxidativo y protege estas células del daño oxidativo en algunos casos de infertilidad idiopática (27-29). Furthermore, the rapid effects of PEA and OEA on sperm suggest that these agents may exert their physiological role on human spermatozoa through other possible mechanisms not involving ROS, such as the one that does not require CB receptors, which could be contained in human sperm such as the GPR55, GPR119, and the peroxisome proliferator-activated receptors (18).

The lipophilic nature of PEA and OEA suggest that these compounds may interact with sperm plasma membrane lipid bilayers and alter membrane polarity (49–51) to induce changes in plasma membrane composition and fluidity. This would increase membrane permeability to some molecules, such as calcium and bicarbonate, which are essential for the induction of sperm motility and capacitation (29). Decreased sperm plasma membrane fluidity and polarity are common features associated with spermatozoa from men with oligozoospermia and some idiopathic normozoospermic men

(52) and PEA and OEA are known to increase the rate of capacitation in sperm from men with oligozoospermia and idiopathic normozoospermic men displaying decreased membrane polarity (29).

In conclusion, PEA and OEA levels in human seminal plasma may reflect the overall male reproductive health, including the testes, epididymides, and accessory reproduc-tive glands, and could be exploited as biomarkers for male factor infertility. Palmitoylethanolamide and OEA may there-fore play a crucial role in the preservation of normal sperm function and male fertility. Exocannabinoids, such as D 9 -tetrahydrocannabinol and cannabidiol, that compete with these lipid mediators and may upset their finely balanced, normal functioning and thus result in male reproductive fail-ure. Further investigations into the roles of endocannabioids and exocannabioids in male fertility are thus required.

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