El ribosido de nicotinamida, una forma de vitamina B3, protege contra la degeneración axonal inducida por excitotoxicidad-7

NR se convierte en NAD + en neuronas corticales

No todos los modelos de neuroprotección dependiente de WldS invocan un requisito para la biosíntesis de NAD + (42). En consecuencia, probamos la hipótesis de que el efecto protector de NR depende de su conversión intracelular a NAD + (Fig. 4A). Primero, preguntamos si NR ingresa a las neuronas corticales para una mayor conversión a NAD +. NR es un nucleósido que se informa que cruza las membranas plasmáticas a través de TN (25, 27). Entre las isoformas de NT, el análisis de expresión en nuestro modelo de cultivo de células neuronales indicó que todas las transcripciones equilibradas del transportador de nucleósidos (ENT1-4) se expresaron (Fig. 4B). Sin embargo, ninguno de los ARNm concentradores de transportadores de nucleósidos (CNT1-3) pudo ser detectado. DP, un potente inhibidor farmacológico de las actividadesENT1 y-2, bloquea la entrada de células NR en líneas celulares humanas (25, 43). El cotratamiento de las neuronas corticales con 100 mMNMDA, 1mMNR y 50 mMDP evitó casi por completo la protección axonal inducida por NR (la protección axonal disminuyó en un 68%; del 88 al 20%), estableciendo que el efecto neuroprotector de NR requiere transporte sensible a DP a través del plasma membrana (Fig. 4C).


La conversión intracelular de NR a NAD + es iniciada por Nmrk1 / 2, que genera el precursor proximal NAD +, NMN (Fig. 4A) .Expresión de ARN analizado Nmrk1 y -2mRNA por RT-PCR cuantitativa tanto de áreas específicas del cerebro del ratón como de neuronas corticales en cultivo. Descubrimos que el ARNm de Nmrk1 se expresa constitutivamente en todos los tejidos, mientras que el ARNm de Nmrk2 estaba ausente en todas las áreas del cerebro (corteza, hipocampo y cerebelo) (Fig. 4D, E). Sin embargo, la transcripción de Nmrk2 se expresó altamente en los músculos esqueléticos del corazón y estriados, como se describió anteriormente (30, 44). El ARNm de Nmrk1 pero no Nmrk2 también se expresó en neuronas corticales cultivadas (Fig. 4E). Se informó que el ARNm de Nmrk2 se indujo en neuronas PNS después de la axotomía del nervio ciático (7). Para investigar una posible inducción de Nmrk2 después de un ataque excitotóxico en neuronas corticales, se cuantificó el ARNm de Nmrk2 después de un tratamiento con 100 mMNMDA durante 24 h. Encontramos una baja inducción de la transcripción de Nmrk2, pero un aumento de 4 veces del ARNm de Nmrk1. La actividad de la quinasa NR conduce a la formación de NMN, que está adenilada a NAD + a través de las enzimas Nmnat. Analizamos la expresión de ARNm de Nmnat1-3 en neuronas corticales tratadas o no con NMDA 100 mM durante 3 o 24 h. Demostramos que todas las transcripciones se expresan, con el nivel más alto para la isoforma citosólica Nmnat2, seguido de la enzima mitocondrial Nmnat3 (Figura complementaria S2A). Cada uno de los ARNm fue inducido por un tratamiento de NMDA de 24 h, de modo que todos los componentes de la ruta de la quinasa NR a la biosíntesis de NAD + fueron regulados positivamente durante el ataque neuronal. La conversión de NR a NAD + puede iniciarse por la nucleósido fosforilasa, que convierte NR a NAM, que además se convierte a NAD + (45). Sin embargo, el cotratamiento de neuronas corticales con NMDA 100 mM y NAM 5 mM durante 24 h demostró que NAM es incapaz de prevenir la AxD inducida por NMDA (Figura complementaria S2B). Luego evaluamos los niveles de NAD + en las neuronas durante un desafío excitotóxico. El tratamiento de neuronas corticales con NMDA 100 mM durante 24 h indujo una disminución del 36% en NAD + intracelular. Este efecto fue revertido por cotratamiento con NR 1 mM (Fig. 4F). Juntos, estos resultados establecen que la conversión de NR a NAD + intracelular a través de la oposición de la NR quinasa inducida por la transcripción a la AxD inducida por excitotoxicidad.


NR

Figura 3. El efecto protector NR está restringido principalmente al compartimento axonal. A – E) Análisis de microscopía de fluorescencia del estado somático y AxD después de la exposición de neuronas corticales a NMDA 100 mM y NR 1 mM. Cada tratamiento de molécula se añadió durante 24 h. Izquierda: el compartimento somático teñido con Hoechst 33342; derecha: el compartimento axonal teñido con anti-b3-tubulina. Condición de control (ø / ø) (A); tratamiento somático con NMDA (NMDA / ø) (B); cotratamiento somático de NMDA-NR y tratamiento axonal de NR (NR-NMDA / NR) (C); cotratamiento somático NR-NMDA (NR-NMDA / ø) (D); y tratamiento con NMDA somático y tratamiento con NR axonal (NMDA / NR) (E). Barras de escala, 20 mm. F, G) Cuantificación de AxD después del tratamiento con NMDA 100 mM y el tratamiento NR 1 mM total, proximal o distal (F) o el tratamiento con NAD + 5 mM (G) (n = 3). * P, 0,05.

nr-2


Figura 4. NR extracelular se transporta a través de la membrana plasmática para un efecto neuroprotector y se metaboliza a NAD + intracelular. A) Representación esquemática del metabolismo de NR en las células: NR ingresa a la célula a través de CNT o ENT y se metaboliza a NAD + a través de NR quinasa 1/2 (Nmrk1 / 2) y Nmnat. B) nivel de ARNm de ENT 1-4 normalizado a transcripción de HPRT en neuronas corticales. C) DP revirtió el efecto protector de axones de NR en neuronas tratadas con NMDA. Cuantificación de AxD después del tratamiento con NMDA 100 mM, con o sin NR 1 mM y DP 50 mM durante 24 h (n = 4). D) El ARNm de Nmrk1 se expresa constitutivamente, mientras que el ARNm de Nmrk2 no es detectable en los tejidos cerebrales. Nivel de ARNm de Nmrk1 y Nmrk2 en tejidos cerebrales (corteza, hipocampo y cerebelo), corazón, músculos esqueléticos e hígado normalizados a transcripción de b-actina. E) El tratamiento con NMDA induce la transcripción de Nmrk1 pero no de Nmrk2. Los niveles de ARNm se analizaron por PCR cuantitativa en tiempo real 3 y 24 h después del tratamiento con NMDA 100 mM y se normalizaron a la transcripción de HPRT (n = 3). F) El tratamiento con NR restaura el agotamiento de NAD + inducido por NMDA. El nivel de NAD + se midió en neuronas corticales cultivadas en placas y expuestas a NMDA 100 mM, con o sin NR 1 mM durante 24 h (n = 4). * P, 0.05, ** P, 0.01, *** P, 0.001.