El ribosido de nicotinamida, una forma de vitamina B3, protege contra la degeneración axonal inducida por excitotoxicidad-5

RESULTADOS

El tratamiento con NMDA en los cuerpos celulares neuronales induce la muerte neuronal y la degeneración axonal.

Para diseccionar los efectos protectores de NAD + y NR en AxD, cultivamos neuronas corticales en dispositivos microfluídicos que contienen 3 cámaras conectadas entre sí (37). Cuando se sembraron en la cámara izquierda, las neuronas corticales proyectaron sus axones desde la cámara proximal a la distal a través de microcanales filtrantes asimétricos, mientras que los somas y las dendritas estaban confinados en la cámara izquierda. Como consecuencia de dicha compartimentación, la cámara derecha del dispositivo microfluídico contenía solo axones. Cuando se despresuriza, la cámara central actúa como sifón y garantiza un aislamiento fluido óptimo de las cámaras distal axonal y somatodendrítica (Fig. 1A, B). El análisis de las dendritas (MAP2, rojo), la cromatina nuclear (Hoechst 33342, azul) y los axones (b3-tubulina) indicaron que las neuronas corticales sembradas estaban sanas después de 2 semanas en cultivo (Fig. 1C). La aplicación somatodendrítica de NMDA 100 mM en la cámara proximal indujo degeneración de dendrita marcada por una pérdida de inmunotinción de MAP2 y condensación nuclear asociada con una AxD severa visualizada por inmunotinción puntiforme de b3-tubulina en la cámara distal (Fig. 1C-G). Por el contrario, la aplicación local de NMDA a los axones en la cámara distal no tuvo efecto en las neuronas, lo que es coherente con el hecho de que los receptores de NMDA (NMDAR) están localizados exclusivamente en el compartimento somatodendrítico (22) (Fig. 1E-G). La participación de NMDAR en la neurodegeneración inducida por NMDA se confirmó con el antagonista de NMDAR no competitivo MK-801. La condensación nuclear y el AxD después de 8 h de tratamiento con NMDA se bloquearon completamente mediante la coadición de 10 o 50 mM de MK-801 (Fig. 1H, I).


NR tiene un efecto neuroprotector más fuerte que NAD + durante la excitotoxicidad, tanto in vitro como in vivo

Para evaluar y comparar las propiedades neuroprotectoras potenciales de NAD + y NR, las neuronas corticales se trataron con 100 mMNMDA en presencia o ausencia de 5 mM NAD + o 1 mMNR. La condensación nuclear y el AxD se cuantificaron con el tiempo. Como se muestra en la Fig. 2A, después de 24 h de tratamiento, no se observó inhibición de la degeneración de dendrita (MAP2) ni inhibición de la condensación nuclear después del tratamiento con NAD + o NR, mientras que ambas moléculas retrasaron AxD (Fig. 2A-C). La protección NAD + fue débil (67% de protección en comparación con el efecto NMDA después de 8 h de tratamiento, 22% después de 24 h), mientras que los axones totalmente protegidos NR después de 8 h y todavía proporcionaron 72% de protección 24 h después del tratamiento NMDA (Fig. 2C) . Las eficiencias NAD + y NR también se compararon en un ensayo de rango de dosis en neuronas corticales cotratadas con NMDA 100 mM durante 24 h (Fig. 2D).


NAD + comenzó a retrasar AxD de 5 mM. En contraste, NR fue eficiente con una dosis 10 veces menor (0.5 mM; 33 vs. 43% de protección) con una actividad protectora máxima a 1 mM. Preguntamos si la ausencia de protección de NAD + y NR en la condensación nuclear inducida por NMDA se debió a la alta dosis de NMDA (100 mM) que condujo a una degeneración irrecuperable. Por consiguiente, desafiamos NAD + 5 mM o NR 1 mM con una concentración de NMDA 10 mM más baja durante 24 h (Figura complementaria S1). Se observó una menor condensación nuclear con NMDA 10 mM (30%) en comparación con la obtenida con NMDA 100 mM (53%) pero ni NAD + ni NR tuvieron ningún efecto protector sobre este fenómeno.


Considerando las diferentes actividades neuroprotectoras de NAD + y NR en nuestro modelo in vitro de excitotoxicidad, preguntamos si NAD + y NR podrían ser neuroprotectores en un contexto in vivo de excitotoxicidad. Para este propósito, coinyectamos NMDA (5 nmol) y NAD + o NR (50 nmol cada uno) en estructuras corticales intomouses según lo publicado (40). Sorprendentemente, el volumen de la lesión inducida por NMDA medida por MRI se redujo significativamente después de la coinyección NR, mientras que NAD + no reveló una protección significativa (Fig. 2E, F). Por lo tanto, NR tiene un efecto neuroprotector más potente que NAD + en la neurodegeneración inducida por NMDA, tanto in vitro como in vivo.

Nicotinamide Riboside

Figura 1. La aplicación somática de NMDA en neuronas corticales induce muerte neuronal y degeneración axonal. A) Representación tridimensional de dispositivos microfluídicos compuestos por 3 cámaras separadas conectadas por microcanales en forma de embudo. Las neuronas corticales se siembran en la cámara proximal y los axones alcanzan la cámara distal después de 4 a 6 días in vitro. Un canal central sobrepresionado permite un aislamiento fluido óptimo y un tratamiento compartimentado entre los compartimentos somático y axonal. B) Imagen de microscopio óptico de microcanales entre las cámaras proximales y distales. C – E) Micrografías representativas de compartimentos somáticos y axonales después del tratamiento con NMDA. Las neuronas corticales se cultivaron durante 11 días y se trataron durante 24 horas con NMDA 100 mM. Izquierda: el compartimento somatodendrítico teñido con anti-MAP2 (rojo) y Hoechst 33342 (azul). Los asteriscos denotan núcleos condensados. Derecha: el compartimento axonal teñido con tubulina anti-b3: condición de control (ø / ø) (C); tratamiento somatodendrítico con NMDA (NMDA / ø) (D); y tratamiento axonal selectivo con NMDA (ø / NMDA) (E). Barras de escala, 20 mm. F) Cuantificación de la condensación nuclear en el control y después del tratamiento de NMDA compartimentado. Los núcleos condensados se contaron después de la tinción de Hoechst (n = 3). G) Cuantificación de AxD en el control y después del tratamiento de NMDA compartimentado (n = 3). El índice de fragmentación axonal se calculó como se describe en Métodos. H, I) Efecto del antagonista de NMDA MK-801 sobre la picnosis nuclear inducida por NMDA y AxD: las células se cotrataron con NMDA 100 mM y MK-801 10/50 mM en el compartimento somatodendrítico. Cuantificación del estado somático (H) y AxD (I) (n = 3). * P, 0,05.