El ribosido de nicotinamida, una forma de vitamina B3, protege contra la degeneración axonal inducida por excitotoxicidad-3

Tratamientos farmacológicos

Las células fueron pretratadas y / o tratadas entre 11 y 13 días in vitro. Para asegurar el aislamiento fluídico, se mantuvo una presión hidrostática diferencial entre compartimientos.

Se usaron los siguientes compuestos: NMDA, (100 mM; M3262; Millipore-Sigma), FK866 (10 mM; F8557; Millipore-Sigma), NAD + (N3014; Millipore-Sigma), NMN (N3501; Millipore-Sigma), NR (ChromaDex, Irvine, CA, EE. UU.), NAM (N0636; Millipore-Sigma), dipiridamol (DP, 50 mM; D9766; Millipore-Sigma), monofosfato de citidina (CMP; 25 mM; C1006; Millipore-Sigma), y ( +) MK-801-maleato (10/50 mM; 0924; Tocris Bioscience, Bristol, Reino Unido).

Detección de inmunofluorescencia y adquisición de imágenes.

En diversos momentos, los cultivos se fijaron con paraformaldehído al 4% (p / v) (15714-S; Euromedex, Souffelweyersheim, Francia) + 4% (p / v) de sacarosa (S0389; Millipore-Sigma) durante 20 minutos a temperatura ambiente. Luego, las células se lavaron una vez con PBS durante 10 min y se permeabilizaron durante 30 min con D-PBS que contenía TritonX-100 (Millipore-Sigma) al 0,2% (v / v) y BSA (Millipore-Sigma) al 1% (p / v). La inmunotinción se realizó como se describe en Magnifico et al. (6) utilizando los siguientes anticuerpos conjugados diluidos en D-PBS: tubulina anti-bIII-Alexa Fluor 488 (1: 500, AB15708A4; Millipore-Sigma) y proteína 2 asociada a anti-microtúbulos (MAP2) -Alexa 555 (1: 500, MAB3418A5; Millipore-Sigma). Los núcleos celulares se tiñeron usando Hoechst 33342 (2 mg / ml). Los chips se enjuagaron una vez con PBS y se llenaron con PBS + 0,1% de azida de sodio. Las imágenes se adquirieron con un microscopio Axio-observador Z1 (Zeiss, Wetzlar, Alemania) equipado con una cámara CCD enfriada (CoolsnapHQ2; Roper Scientific, Trenton, NJ, EE. UU.). El microscopio se controló con el software Metamorph (Berlín, Alemania), y las imágenes se analizaron con el software ImageJ (Institutos Nacionales de Salud, Bethesda, MD, EE. UU.).

 

Cuantificación de la fragmentación axonal y muerte neuronal.

La fragmentación axonal se evaluó con una macro desarrollada en el software ImageJ que contenía los siguientes pasos: 1) restar el fondo, 2) conectar el tubo (s = 1), 3) conectar el umbral de Otsu ,

y 4) analizar partículas midiendo el área total de partículas (ATOTAL) e identificando partículas con una circularidad superior a 0.2 (A0.2). El índice de fragmentación se obtiene como la relación A0.2 / ATOTAL. Este índice está correlacionado casi linealmente con porcentajes de axones fragmentados: los índices inferiores a 0,2, 0,5 y hasta 0,8 corresponden a 10, 50 y más del 90% de axones fragmentados, respectivamente. La muerte neuronal se cuantificó calculando la relación de núcleos de condensación a núcleos totales.