El ribosido de nicotinamida, una forma de vitamina B3, protege contra la degeneración axonal inducida por excitotoxicidad-4

PCR y PCR cuantitativa en tiempo real

Las neuronas corticales primarias se lisaron en DIV 11, y los tejidos se lisaron de ratones de 8 semanas de edad. Se agruparon tres pozos para obtener 1 muestra. El ARN total se aisló con un kit RNeasy (74104; Qiagen, Valencia, CA, EE. UU.) De acuerdo con el protocolo del fabricante. Del ARN total, 1 mg se trató con DNasa libre de RNasa y se volvió a transcribir con un kit de transcriptasa inversa SuperScript II (18064-022; Thermo Fisher Scientific) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El ARN restante se hidrolizó usando RNasa H de E. coli (AM2293; Thermo Fisher Scientific).

La amplificación por PCR se realizó en un termociclador mezclando 2 ml de ADNc con 0,5 mM de secuencias de nucleótidos directa e inversa (Tabla 1) en un tampón de PCR que contiene una mezcla de dNTP (200 mM cada uno), MgCl2 (1,5 mM) y 0,5 U de Taq ADN polimerasa (18038; Thermo Fisher Scientific). Inicialmente, la plantilla se desnaturalizó calentando a 95 ° C durante 5 minutos, seguido de 30 ciclos de amplificación. Cada ciclo consistió en 3 pasos: el primero durante 45 segundos a 94 ° C, el segundo durante 30 segundos a la temperatura de recocido (dependiendo del ARNm amplificado) ), y el tercero durante 1 minuto a 72 ° C para la polimerización. El paso final fue una extensión a 72 ° C durante 10 min. Los productos de PCR se sometieron a electroforesis en gel de agarosa al 1,5% (p / v) y se tiñeron con bromuro de etidio (0,5 mg / ml).

La PCR cuantitativa se realizó con un LightCycler480 (Roche Applied Science, Penzberg, Alemania), mezclando ADNc diluido 1:50 con los cebadores específicos de destino y la mezcla Light Cycler 480 SYBRGreen I Master (4707516001; Roche, Basilea, Suiza) de acuerdo con el Instrucciones del fabricante. Las condiciones de amplificación fueron desnaturalización inicial durante 5 minutos a 95 ° C

seguido de 40 ciclos de 10 s a 95 ° C, 15 s a temperatura de recocido y 10 s a 72 ° C. Los resultados se analizaron con el software LightCycler 480 SW 1.5. Los productos de PCR individuales fueron analizados por

análisis de punto de fusión. El nivel de expresión de un gen se normalizó en relación con el de la b-actina o la hipoxantina guanina fosforibosil transferasa (HPRT) de ratón.


Ensayo NAD +

Se midió NAD + usando el kit de ensayo EnzyChrom NAD + / NADH (E2ND-100; Euromedex) de acuerdo con el protocolo del fabricante. La metabolómica cuantitativa NAD + dirigida se realizó como se describe en Trammell y Brenner (38).


Experimentos de excitotoxicidad inducidos por NMDA in vivo

Los experimentos se realizaron en ratones machos C57 / BL6 (23 6 3 g, producidos y proporcionados por las instalaciones de animales GIP Cyc´eron) de acuerdo con las Directivas de la Unión Europea (210/63 / UE) y las leyes de ética francesas (R214; 87-137; Minist`ere de l'Agriculture) sobre experimentación animal y fueron aprobados por el Comité de Bienestar Animal de la Universidad Normandía de Caen. Los ratones se anestesiaron profundamente con isoflurano al 5% y se mantuvieron bajo anestesia con isoflurano al 2% en una mezcla de gases al 70/30% (N2O / O2) durante la cirugía. La temperatura rectal se mantuvo a 37 60,5 ° C durante todo el procedimiento quirúrgico utilizando un sistema de calentamiento regulado por retroalimentación.

Una inyección cortical unilateral [coordenadas: 0.5 mm posterior, 2.0 mm lateral, 20.5 mm ventral al bregma (39)] de NMDA (5 nmol; en 0.33 ml), coinyectada o no con NAD + o NR (50 nmol)

se realizó después de colocar a los animales en un marco estereotáxico.

Se inyectaron soluciones mediante el uso de una micropipeta hecha con micropipetas hematológicas (calibradas a 15 mm / ml, asistente ref 555/5; Hecht, Sondheim-Rhoen, Alemania). La micropipeta se retiró 3 minutos después. El volumen de la lesión se analizó 48 h después.


Resonancia magnética

Los experimentos se realizaron en un Pharmascan 7T (Bruker, Bremen, Alemania). Las imágenes ponderadas en T2 se adquirieron con una secuencia multicorte multicorte: TE / TR 51.3 / 2500 ms 48 h después de la inyección. Los volúmenes de las lesiones se cuantificaron en MRI con el software ImageJ.


análisis estadístico

Las diferencias se evaluaron mediante una prueba de Mann-WhitneyUtest para comparar 2 condiciones o una prueba de Kruskal-Wallis para comparar> 2 condiciones.