El ribosido de nicotinamida, una forma de vitamina B3, protege contra la degeneración axonal inducida por excitotoxicidad-2

MATERIALES Y MÉTODOS

Producción de chips microfluídicos

El chipmaster de 3 compartimentos se construyó como se describe en Kanaan et al. (37) Para la producción de chips, el polidimetilsiloxano (Sylgard 184, PDMS; Dow Corning, Midland, MI, EE. UU.) Se mezcló con un agente de curado (relación 9: 1) y se desgasificó al vacío. La preparación resultante se vertió en una réplica de resina de poliéster y se reticuló a 70 ° C durante al menos 2 h. La impresión de polímero elastomérico se separó y se perforaron 2 depósitos para cada macrocanal. La impresión de polímero y un cubreobjetos de vidrio, limpiados con isopropanol y secados, se trataron durante 3 minutos en un generador de plasma de aire (98% de potencia, 0,6 mbar; Diener Electronic, Ebhausen, Alemania) y se unieron. Los chips se colocaron bajo UV durante 20 minutos y luego se revistieron con una solución de poli D-lisina (10 mg / ml, P7280; Millipore-Sigma, St. Louis, MO, EE. UU.) Durante la noche y se lavaron con Dulbecco-PBS (D-PBS) (14190169 ; Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EE. UU.) Antes de la siembra celular. Alternativamente, se compraron chips de 3 compartimentos de Microbrain Biotech (París, Francia).

Cultivo neuronal primario

Todos los animales se mantuvieron éticamente y se utilizaron de conformidad con la Política Europea de Ética. Se cortaron microdisecciones de embriones E14 de ratones suizos (Janvier, Le Genest Saint Isle, Francia) en D-PBS suplementado con glucosa al 0,1% (p / v) (Thermo Fisher Scientific). C57BL / 6Nmice se utilizaron en experimentos de eliminación de Nmrk2 (KO). Las estructuras diseccionadas se digirieron con papaína (15 U / ml en DMEM; 76220; Millipore-Sigma) durante 5 minutos a 37 ° C. Después de la inactivación de papaína con suero fetal bovino al 10% (v / v) (GE Healthcare, Little Chalfont, Reino Unido),

las estructuras se disociaron mecánicamente con una pipeta en DMEM Glutamax-1 (31966; Thermo Fisher Scientific) que contenía DNAse-I (D5025, Millipore-Sigma). Después de 2 centrifugaciones de 7 min a 700 g, las células se resuspendieron en DMEM Glutamax-1 que contenía DMEM Glutamax-1, penicilina (100 U / ml) / estreptomicina (100 mg / ml) (15140; Thermo Fisher Scientific), suero fetal bovino al 5% (v / v),

Suplemento N2 (17502048; Thermo Fisher Scientific) y suplemento B-27 (17504-044; Thermo Fisher Scientific) hasta una densidad final de 50 millones de células / ml. Las células corticales se sembraron en el

compartimento somático Se añadió igualmente medio de cultivo celular a los 4 depósitos. Se colocaron chips microfluídicos en placas de Petri que contenían EDTA al 10% (Millipore-Sigma) y se incubaron a 37 ° C.

en una atmósfera de 5% de CO2. El medio de cultivo se renovó cada 6 d. Tras la diferenciación, los axones corticales entraron en los microcanales y alcanzaron las segundas cámaras después de 4–5 días.

Los axones corticales continuaron creciendo a partir de entonces Ratón Nmrk2-KO Los ratones Nmrk2-KO se obtuvieron mediante la inyección de células madre embrionarias (alelo Vlcg Nmrk2tm1 (KOMP)) del KnockoutMouse

Proyecto (KOMP) en blastocistos C57BL / 6N en el Centro Nacional de Investigación Científica – Transgenia, Archivo y Modelos Animales (CNRS – TAAM) Instalación de animales transgénicos

(ASIENTO; Villejuif, Francia). Todos los exones e intrones del gen Nmrk2 son reemplazados por un gen indicador lacZ para crear un alelo nulo en las células madre embrionarias (Universidad de California, Davis, Davis, CA,

ESTADOS UNIDOS; https://www.komp.org/geneinfo.php?geneid=65082). Se usaron ratones machos quiméricos para obtener ratones mutantes Nmrk2 heterocigotos en un fondo C57BL / 6N. Los ratones homocigotos Nmrk2-Ko eran viables y fértiles. Validamos la eliminación secuenciando el ADN genómico de los ratones KO.