La rotación de NAD + en el músculo esquelético está predominantemente regulada por NAMPT Salvage Of NAM, sin embargo, NR es un precursor más valioso para aumentar NAD +

La rotación de NAD + en el músculo esquelético está predominantemente regulada por el salvamento NAMPT de NAM, sin embargo, NR demuestra ser un precursor más valioso para aumentar NAD +

Como la ruta de la Preiss-Handler de NA se restringe principalmente a la biosíntesis de NAD + en el hígado y el tratamiento de la NA es limitado debido a los efectos adversos, el objetivo fue establecer los precursores de NAD + y las vías que podrían utilizarse para mejorar el contenido de NAD + en el músculo esquelético [15,34] . Los datos de los perfiles de actividad de las enzimas metabólicas sugieren que las rutas amidadas a NAD +, mediadas por las vías de rescate NAMPT y NRK, prevalecen como las principales rutas biosintéticas a NAD + en el músculo, lo que se corrobora con nuestros datos de expresión tisular y análisis molecular [34]. Para seguir evaluando esto, complementamos los miotubos derivados primarios con precursores de NAD + que podrían ser utilizados por las rutas NRK o NAMPT; NAR (versión no amidada de NR), NR, NMN y NAM (Figura 1A) y NAD + cuantificado utilizando un ensayo cíclico. NAR, como NR, se metaboliza por NRK a NAMN y luego a NAAD por NMNATs [40]. Sin embargo, NAAD requiere una amidación final a NAD + a través de la sintetasa NAD [41]. Encontramos que NAR no pudo aumentar el grupo de NAD + en las células musculares, mientras que los suplementos de NR y NMN aumentaron significativamente la cantidad de NAD + en los miotubos en casi 2 veces. Sin embargo, las concentraciones equivalentes de NAM no mejoraron significativamente NAD +, con un exceso de NAM de 10 veces necesario para aumentar NAD + (Figura 3A). NAMPT se considera el paso limitante de la velocidad para la recuperación y síntesis de NAD + en el músculo esquelético [38], pero no se ha explorado en detalle en el contexto de las NRK. Examinamos la recuperación de precursores y los niveles de NAD + en los miotubos tratados con el potente inhibidor de NAMPT FK866 [42]. NAMPT es de hecho esencial para la homeostasis basal de NAD + con niveles de NAD + muy agotados (en más del 70%) después de 24 h de inhibición. Este agotamiento se revirtió completamente con la suplementación de NR y NMN, y ambos precursores aún podían aumentar NAD + en la misma medida que sin el tratamiento con FK866, lo que confirma que el rescate de NR y NMN es independiente de NAMPT (Figura 3B). Para obtener más información sobre la actividad de la NR, utilizamos la metabolómica cuantitativa dirigida basada en LC-MS. La Tabla 1 muestra los niveles de metabolitos clave de NAD + en los miotubos primarios tratados con FK866 y NR. Como se esperaba, los niveles de NAD (H) aumentan significativamente después de la suplementación con NR, y, lo que es más importante, aquí identificamos un gran aumento de NR y NMN celulares de las células de control 24 h después de los tratamientos celulares. Curiosamente, los metabolitos del consumo de NAD +, NAM y ADP ribosa (ADPr), no se alteraron con el tratamiento con NR, pero los niveles se redujeron después del agotamiento de NAD + inducido por FK866, lo que sugiere que la disponibilidad de NAD + es solo una limitación de la tasa de señalización de NAD + por debajo de los niveles normales (Tabla 1). La NA y otros metabolitos de Preiss-Handler y las vías de biosíntesis de novo NAD + no se detectaron en los miotubos primarios. El NAD + es vital para la respiración mitocondrial, por lo que demostramos la importancia de NAMPT para mantener el recambio de NAD + al tratar los miotubos C2C12 con FK866 durante 72 h. La inhibición de NAMPT redujo significativamente la respiración basal y máxima, que se rescató completamente mediante tratamiento con NR durante las últimas 24 h (Figura 3C). La NR sola no mejoró la respiración mitocondrial por encima de los niveles no tratados (Figura 3C). Concordantemente, la apoptosis se estimuló en los miotubos C2C12 después de 48e 72 h de inhibición de NAMPT. La suplementación con NR previno completamente este efecto (Sup. 1B). Se sabe que los cambios en la disponibilidad de NAD + y la energía de las células musculares como resultado de la inhibición de NAMPT estimulan tasas elevadas de transcripción del gen NAMPT a través de la actividad de AMPK; sin embargo, los efectos sobre las NRK en este contexto son desconocidos [43,44]. Usando la PCR en tiempo real, mostramos que la expresión de ARNm celular de los genes de rescate NAD + está estrechamente regulada por la disponibilidad de NAD +. El agotamiento de NAD + por FK866 dio lugar a una regulación al alza de Nmrk2 y Nampt y una regulación a la baja de Nmrk1 (Figura 3D). La reposición de NAD + por la suplementación con NR devolvió los niveles de ARNm de todos los genes a los de las células de control y NR no tratadas (Figura 3D). Estos datos demuestran que el NAMPT es crucial para la biosíntesis basal de NAD +. La suplementación con NR puede rescatar completamente la inhibición de NAMPT a través de la recuperación de NAD + mediada por NRK. Estos datos sugieren que la actividad de NRK es capaz de mantener NAD + celular y que la disponibilidad de NR puede restringir la actividad de NRK en condiciones basales.