Efecto del mononucleótido de nicotinamida sobre los déficits respiratorios mitocondriales cerebrales en un modelo murino relevante para la enfermedad de Alzheimer-3

Condiciones de cultivo de células de neuroblastoma N2A

Se sembraron neuroblastomas de hipocampo N2A de ratón de paso bajo (ATCC, Manassas, VA; 5,000 / pocillo) en microplacas V7 (Seahorse Bioscience, North Billerica, MA) en medios de proliferación ((MEM, (ATCC), suero bovino fetal al 10%, (Gibco , Grand Island, NY), Pen-Strep 1% (Gibco)) y se mantuvo en una incubadora humidificada a 37 ° C y 5% de CO2. Después de 24 h, los cultivos se transfectaron transitoriamente (ver más abajo). , los medios de proliferación se reemplazaron con medios de diferenciación (DM) que constan de MEM, suero de caballo al 2% (Gibco) y 1% de Pen-Strep. Los cultivos tuvieron cambios en los medios usando DM 48 horas después y las tasas de consumo de oxígeno se midieron 24 horas después. Todos los pozos fueron examinados críticamente bajo el microscopio para asegurar la viabilidad celular antes de realizar experimentos.

Generación y transfección de vectores plasmídicos

El vector plasmídico que contiene ADNc para una proteína fluorescente amarilla potenciada dirigida mitocondrialmente (eYFP), APP mutante (swe) y PS1 mutante (ΔE9) descrito en [14] posee un elemento de respuesta de tetraciclina que requiere co-transfección con un transactivador de tetraciclina (TTA, Clontech ) La cotransfección da lugar a células que poseen eYFP dirigido a mitocondrias y APP y PS1 derivadas de transgenes. Los neuroblastomas N2A se cotransfectaron con ambas construcciones o TTA solo (transfección de control) utilizando 1 μg de ADN / construcción / pocillo utilizando el sistema Magnetofection (Oz Biosciences, San Diego, CA) con CombiMag más lipofectamina (Invitrogen, Carlsbad, CA) según al protocolo del fabricante.

Aislamiento de mitocondrias cerebrales no sinápticas

Veinticuatro horas después de las inyecciones finales de NMN o vehículo, se decapitaron APP (swe) / PS1 (ΔE9) o ratones no transgénicos (3 meses) machos y hembras (3 meses), se extrajeron rápidamente los cerebros anteriores y se colocaron en tampón de manitol-sacarosa (MS) helado. pH 7.4 (manitol 225 mM, sacarosa 75 mM, Hepes 5 mM, BSA libre de ácidos grasos 1 mg / ml (Roche Diagnostics, Indianápolis, IN), EGTA 1 mM). Los cerebros anteriores se homogeneizaron con 10 golpes usando un molinillo de tejido Potter-Elvehjem (Wheaton Science Products,

Millville, NJ). Los homogeneizados cerebrales se procesaron adicionalmente utilizando el método de aislamiento Percoll descrito por [22] y como se utilizó anteriormente [14,23]. Este método ha demostrado mostrar un alto nivel de pureza mitocondrial por microscopía electrónica [23]. Las concentraciones de proteínas se determinaron mediante el método descrito por [24] utilizando BSA como patrones. Alícuotas de mitocondrias cerebrales y homogeneizado tenían inhibidores de proteasa (Calbiochem, San Diego, CA) añadidos antes del almacenamiento a -20 ° C para posteriores análisis de transferencia Western.

Respirometría de células de neuroblastoma N2A

Antes de las mediciones, los cultivos se enjuagaron suavemente en tampón de medición de ensayo precalentado (37 ° C) (MB) que consistía en NaCl 120 mM, KCl 3,5 mM, CaCl2 1,3 mM, KH2PO4 0,4 mM, MgCl2 1 mM, HEPES 5 mM (pH 7.4) suplementado con D-glucosa 2.5 mM. Las células se colocaron luego en una incubadora humidificada sin tampón a 37 ° C durante 2 horas para permitir el equilibrio de temperatura y pH. Las células se inspeccionaron visualmente antes y después de la adición de MB y luego se cargaron en el analizador de flujo Seahorse XF24-3 (Seahorse Bioscience). Después de una etapa de equilibrio, se registraron las tasas de consumo basal de oxígeno (OCR, pMoles / min) utilizando una mezcla de 3 minutos, 2 minutos de espera y 3 minutos de medición (en bucle 3 veces) antes de la inyección de oligomicina para inhibir la ATP sintasa . Se registraron tres ciclos de medición más antes de la inyección de cianuro de carbonilo p- (trifluorometoxi) fenilhidrazona (FCCP) para inducir el consumo máximo de oxígeno. Después de registrar 3 bucles de medición más, se inyectó piruvato para determinar si el consumo máximo de oxígeno después de la adición de FCCP era limitado al sustrato. Se inyectó antimicina A (inhibidor de la respiración mitocondrial) después de 3 ciclos de medición para evaluar la OCR no mitocondrial. Se registraron dos bucles de medición después de la inyección de antimicina A y luego se terminó el experimento. Los inyectados preparados en MB (volúmenes de 75 μl) se precargaron, luego se inyectaron secuencialmente como se indica a través de los puertos en el cartucho de calibración XF24 a concentraciones finales de oligomicina 1 μg / ml, FCCP 1 μM, piruvato 10 mM y antimicina A. 1 μM. La placa tenía un subconjunto de células incubadas con dinucleótido de adenina nicotinamida 10 mM (NAD +, durante la preincubación de DM) antes de las mediciones.

Respiometría mitocondrial cerebral

Después de la calibración del analizador de flujo Seahorse XF24-3 (Seahorse Bioscience), los gránulos mitocondriales no sinápticos finales de cerebros de ratones individuales se resuspendieron en tampón MAS1 [25] y 5 μg de proteína como se determinó anteriormente [24] cargado en cada uno de los 20 pocillos de una placa de cultivo celular XF24 V7 (Seahorse Bioscience). Las placas se centrifugaron a 1.600 × ga 4 ° C durante 5 min. El tampón MAS1 con malato L 5 mM más piruvato sódico 5 mM (recién hecho en tampón MAS1) se añadió suavemente a los pocillos y las placas cargadas inmediatamente en el instrumento y las mediciones de consumo de oxígeno se registraron como se describió anteriormente [14]. Todas las mediciones se realizaron a 37 ° C.