Efecto del mononucleótido de nicotinamida sobre los déficits respiratorios mitocondriales cerebrales en un modelo murino 4 relacionado con la enfermedad de Alzheimer

Inmunotransferencia

Las proteínas según lo determinado por [24] de los homogeneizados cerebrales o las mitocondrias no sinápticas (50 μ g) de APP (swe) / PS1 ( Δ E9) y sus compañeros de camada no transgénicos (3 meses) se resolvieron usando gel de poliacrilamida con dodecilsulfato de sodio electroforesis (SDS-PAGE) en geles Mini-Protean TGX prefabricados con geles KD (Bio-Rad, Hercules, CA) y transferidos a una membrana de difluoruro de polivinilideno utilizando un sistema de transferencia Trans-Blot Turbo (Bio-Rad). La inmunotransferencia se realizó de acuerdo con el protocolo de Li-Cor Biosciences (Lincoln, NE). Brevemente, los sitios no específicos se bloquearon en tampón de bloqueo no mamífero (Li-Cor Biosciences). Después del bloqueo, las membranas se incubaron con anticuerpos primarios contra Beta amiloide 1–16 (6E10, 1: 1,000; Covance); Histona desacetilasa sirtuina 1 (SIRT1, 1: 500; Millipore); NAD + glicohidrolasa CD38 (CD38; 1: 2,000; I + D, Minneapolis, MN); Proteína 1 relacionada con la dinamina (DRP1, 1: 1,000; BD Biosciences, San Jose, CA); Phospho-DRP1 (P616-DRP1, 1: 1,000; Tecnología de señalización celular, Danvers, MA); Mitofusin 2 (MFN2, 1: 1,000; Abcam, Cambridge, MA); Proteína de atrofia óptica (OPA1, 1: 1,000; BD Bioscience); Glyceraldehyde 3-fosfato deshidrogenasa (GAPDH; 1: 14,000; Tecnología de señalización celular); Canal de aniones dependiente de voltaje (VDAC, 1: 1,000; (conejo); Tecnología de señalización celular); VDAC (ratón; 1: 1,000; itosciences (Eugene, OR); β- Actin (1: 10,000; Sigma) a 4 ° C durante la noche. Después de 4 × 5 min lavados en solución salina tamponada con fosfato (PBS) con 0.1% de tween-20 (PBST), las membranas se incubaron en el anticuerpo secundario conjugado con fluoróforo infrarrojo (IR) apropiado (Li-Cor Biosciences) durante 30 minutos en la oscuridad. Después del lavado con PBST, la señal IR se capturó en un sistema de imágenes infrarrojas Odyssey (Li Cor Biosciences) y se almacenó como una imagen digital.VDAC se utilizó como control de carga para mitocondrias y GAPDH o β- Actina para homogeneizar el cerebro para garantizar una carga igual.

 

Histología

Hombres y mujeres CaMK2a-mito / eYFP, (3 meses) se fijaron en perfusión bajo anestesia profunda y luego se procesaron como se describió anteriormente [26].

 

Microscopía confocal de escaneo láser y cuantificación de la morfología mitocondrial

Cuarenta secciones de tejido cerebral coronal de grosor μm de ratones CaMK2a-mito / eYFP (3 meses) se lavaron con solución salina tamponada con fosfato de potasio (KPBS), luego se montaron y se cubrieron con un cubreobjetos usando medios de montaje Vectashield Hard set (Vector, Burlingame, CA). Se tomaron imágenes de las mitocondrias en secciones del cerebro de subregiones del hipocampo CA1 utilizando un confocal de escaneo láser Zeiss LSM 510

microscopio utilizando una lente de aceite Plan-Apochromat 63x / 1.4. Se registraron planos individuales de 1024 × 1024 píxeles a 1.0 –1.5 Agujero de la unidad Airy cada 0.2 µm de separación z en toda la sección de tejido como se describió previamente [26] con modificaciones. Específicamente, se obtuvieron imágenes de la pila z

de los extraños del cuerpo estriado de la subregión CA1. Se usó un láser de 488 nm para visualizar eYFP. Se tomaron cuatro imágenes de pila z por cerebro de ratón. Las imágenes grabadas se analizaron con el software Volocity (Perkin Elmer, Waltham, MA). Cuantificación de la morfología mitocondrial utilizando

Volocity software se realizó como se describió anteriormente [26]. La siguiente ecuación se usó para determinar el factor de forma 3D (relación del área de superficie de una esfera (con el mismo volumen que el objeto dado) al área de superficie del objeto): V0 = volumen del objeto;

gihi-nmn

 

análisis estadístico

Los datos se expresan como medias ± EE, y las comparaciones entre los grupos experimentales se realizaron con el software estadístico SPSS (SPSS, Inc., Chicago, IL) utilizando el análisis de varianza (ANOVA). El método Posthoc Holm-Sidak se utilizó para todas las comparaciones por pares después de las pruebas ANOVA.

Se usó la prueba t de Student cuando se analizó la comparación directa de dos grupos (datos de volumen). Se asumió significación a p <>

 

Resultados

El NAD + exógeno revierte las tasas de consumo de oxígeno deficiente (OCR) en un modelo basado en células de toxicidad beta amiloide Las células de neuroblastoma hipocampal N2A se cotransfectaron transitoriamente con construcciones que contienen APP mutante (swe) / PS1 ( Δ E9) y un transactivador de tetraciclina (TTA) como un modelo basado en células de los efectos de la toxicidad amiloide mutante. Las células N2A cotransfectadas (transfectadas) o transfectadas con TTA (control) se preincubaron ± dinucleótido de nicotinamida adenina (NAD +) y se midieron las tasas de consumo de oxígeno (OCR). Las células N2A transfectadas (sin NAD + exógeno; línea de trazos azules) habían disminuido la OCR máxima cuando se las desafió con p- (trifluorometoxi) fenilhidrazona (FCCP) de cianuro de carbonilo desacoplador y piruvato, en comparación con las células de control + NAD + (disminución del 24%; Figura 1, sólido rojo) línea); o células de control sin adición exógena de NAD + (disminución del 18%; Figura 1, línea discontinua roja). Este déficit de OCR (Figura 1, línea discontinua azul) podría mejorarse si existiera NAD + exógeno (aumento del 27%; Figura 1, línea continua azul). Los cultivos de control N2A tuvieron un OCR similar independientemente de la adición de NAD + (Figura 1, línea roja sólida versus línea discontinua roja). Estos experimentos sugieren que las deficiencias en los niveles de NAD + podrían desempeñar un papel en la disfunción respiratoria mitocondrial en ratones transgénicos que expresan esta mutación in vivo [14] y podrían corregirse con NAD + añadido.